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大鼠内皮素(ET)酶联免疫分析(ELISA) 试剂盒使用说明书

发布时间: 2023-08-28  点击次数: 335次

    鼠内皮素(ET)酶联免疫分析(ELISA)

    试剂盒使用说明书

    本试剂仅供研究使用

         详情及价格请联系本公司

    实验目的:

    本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆、组织匀浆及相关液体本中内皮素(ET)的含量。

    验原理:

    本试剂盒应用双抗体夹心法测定大鼠标本内皮素(ET)水平。用纯化的内皮素(ET)捕获抗体包被微孔板,制成固相体,往包被的微孔中依次加入内皮素(ET),再与HRP标记的检测抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过C底洗涤后底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的内皮素(ET)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品内皮素(ET)含量

    试剂盒组成

    试剂盒组成

    48孔配置

    96孔配置

    保存

    说明书

    1份

    1份


    封板膜

    2片

    2片


    密封袋

    1个

    1个


    酶标包被板

    1×48

    1×96

    2-8℃保存

    标准品

    0.3ml×6管

    0.3ml×6管

    2-8℃保存

    酶标试剂

    5 ml×1瓶

    10 ml×1瓶

    2-8℃保存

    样品稀释液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    显色剂A液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    显色剂B液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    终止液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    20×浓缩洗涤液

    15ml×1瓶

    25ml×1瓶

    2-8℃保存

    样本处理及要求
    1、组织标本:对于样本要求保持鲜重称取样本中的重量不小于50mg,一般以1g为基准,但不严格要求固定样本每个重量必须达到相同的水平。匀浆的比例选取10%,相当于1g组织加9ml的匀浆液来进行匀浆。匀浆液选取PBS(PH=7.2-7.4,浓度为0.01mol/L)匀浆过程选用组织匀浆器,冰浴上匀浆。(或者进行液氮碾磨)离心取上清,离心转速选用5000转每分,时间是15分钟。取上清液待检

    2-1、贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗,然后用胰蛋白酶消化,1000×g离心5分钟后收集细胞;悬浮细 胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS 洗涤3次。每 1×106 个细胞中加入150-200μL PBS重悬并通过反 复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500×g离心10分钟,取上清检测。

    2-2超声波破碎条件:用20kHz频率,150W的功率,在冰浴中进行超声波破碎,每破碎2s,间隔3s,反复破碎三次。

    2-3反复冻融:收集细胞悬液,4℃低温离心(3000rpm,5min),弃上清,加入一定量PBS(200ul),轻轻吹打混匀,-20℃ 冷冻30 min,37℃解冻,如此反复3次,可形成细胞裂解液。

    3、标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但避免反复冻融.

    4、不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

    操作步骤

    1. 标准品的加样:设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

    2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀

    3. 加酶:每孔加入酶标试剂100μl,空白孔除外

    4. 温育:用封板膜封板后置37℃温育60分钟

    5. 配液:将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

    6. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

    7. 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟

    8. 终止:每孔加终止50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)

    9. 测定:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)测定应在加终止液后15分钟以内进行。

    计算:

    以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

    注意事项:

    1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。样本在使用前也要在室温平衡60分钟。

    2. 浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。

    3. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

    4. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。

    5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

    6. 底物请避光保存。

    7. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

    8. 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

    9. 本试剂不同批号组分不得混用。

    技术提示:

    1、混合蛋白溶液时,避免起泡。

    2、加校准品与样本时,每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头,公共组分应该悬臂加样,避免交叉污染。

    3、合适的温育时间,和充分的洗涤步骤,是保证实验结果准确性的必要条件。

    4、底物溶液为无色液体,保存过程中变为蓝色,代表底物溶液已经失效,不得使用。

    5、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致,加入终止液后,蓝色底物产物,会瞬间变为黄色。

    6、实验中,用剩的板条,应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。

    7、所有液体组分,使用前充分摇匀,严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。

    8、检测必须符合实验室管理规范的规定,严格防止交叉污染,所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。

    试剂盒性能:

    1. 样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。

    2. 批内变异系数与批间变异系数应分别小于10%和15% 。

    保存条件及有效期:

    1. 试剂盒保存:2-8

    2.有效期:6个月




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