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PCR试剂盒的使用方法

发布时间: 2022-08-16  点击次数: 1020次


一、稀释PCR阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)
1. 注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
2. 标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。
3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液(用带芯枪头,下同)。
4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头,在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中,充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备
8. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10E4 拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10E5 拷贝/μL,10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品,则PC和NC的体积也必须是200μL。
9. 用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。

三、设置qPCR反应(20 μL体系,在样品制备室进行)
10. 如果只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复,则反应设置数量相应增加2或3倍。
11. 产品仅用于科研在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加)
注意事项:
1. 建议使用新鲜采取的动物组织,若为长期冷冻组织,应尽量避免反复冻融,否则会导致模板的降解,影响PCR效率。
2. 试剂Buffer AL若低温保存,易产生沉淀。在使用前务必将其在室温中放置一段时间,也可在37℃水浴中预热10 min,以溶解沉淀,混匀后再使用。
3. 电泳检测时,切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则,电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带,影响实验结果。
4. 建议扩增片段长度1 kb以内,以便扩增效率佳。
5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

保存方式
冰袋运输。-20℃避光储存,有效期一年。本品避免反复冻融。建议分装保存。

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